卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內(nèi)的多種組織內(nèi)的，具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤?？ㄎ鞑ㄈ饬鯧S已經(jīng)被鑒定出多種細(xì)胞標(biāo)記物，但是其來源依然是一個(gè)迷。美國的科學(xué)家之前發(fā)現(xiàn)卡西波肉瘤相關(guān)的皰疹病毒（KSHV）能夠使大鼠的原代間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）感染，變形，并且重新編輯，使其分化為類卡西波肉瘤細(xì)胞。在這次的實(shí)驗(yàn)中，科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質(zhì)干細(xì)胞，包括骨髓（MSCbm），脂肪組織（MSCa），牙髓，牙齦組織（GMSC），和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的穩(wěn)定株。其中，這些細(xì)胞表達(dá)了混合的KS標(biāo)記物，并且顯現(xiàn)出不同的血管生成、侵襲和變形的現(xiàn)象，而LTC-KMSCs表現(xiàn)出比未感染細(xì)胞更低的增殖率。進(jìn)而研究人員發(fā)現(xiàn)KSHV介導(dǎo)的血管生成是通過KSHV介導(dǎo)的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明，在人體內(nèi)MSCs是KSHV的靶細(xì)胞，會建立起多種KSHV感染的模型。

研究人員采用各種MSCs，鋪在基質(zhì)膠上，孵育8小時(shí)，對比不同細(xì)胞的分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1）細(xì)胞：  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2）培養(yǎng)基：      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3）基質(zhì)膠：    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4）耗材：    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506)

5）其他：        細(xì)格紙                                  

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1）準(zhǔn)備基質(zhì)膠

①　將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中，注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

②　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

③　準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。

④　將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

⑤　37℃至少孵育30分鐘，使基質(zhì)膠固化。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

3）鋪細(xì)胞

①　每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。

②　將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

③　每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠尅?/span>

④　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。

⑤　蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

4）采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果

37度 5% CO2孵育8小時(shí)后，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測量和統(tǒng)計(jì)。

三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對比LTC-KMSCs幾種細(xì)胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質(zhì)干細(xì)胞，KSHV會增強(qiáng)血管形成效果。圖像是鋪細(xì)胞后8小時(shí)采集，100倍放大倍數(shù)。

1. 為了研究KSHV相關(guān)的miRNA的作用，對比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10個(gè)pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉(zhuǎn)的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉(zhuǎn)錄病毒重新表達(dá)這10個(gè)miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細(xì)胞的血管生成。發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)miRNA對于細(xì)胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強(qiáng)。兩組結(jié)果均是鋪細(xì)胞8小時(shí)后以100倍放大倍數(shù)采集圖像。